一、細胞複蘇

将凍存細胞從(cóng)液氮中取出後，在37C水浴鍋内不斷搖動(dòng)促進其融化。移人15ml離心管中，加入10m預熱的DMEM培養基，輕輕吹

勻，離(lí)心，2000rpmX2min，棄(qì)上清液。加入10mIDMEM培養基清洗，棄上清液。加入10mlDMEM培養基，輕輕吹打，接種於(yú)10cm盤(pán)中，在含5%CO2的細胞培養箱中培養。

二、細胞傳代

細胞密度達(dá)到80%~90%時(shí)．去培養基，10mlPBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA，放人細胞培養箱3min。加人1mlDMEM

培養(yǎng)基終止，轉移至15ml離(lí)心管。

加入10mlPBS清洗細胞培養盤，轉移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。再加入10mlPBS(經(jīng)高壓滅菌，保存於(yú)40C)，吹

勻，吸取10微升進行計(jì)數，按照1×106/盤接種，在含5%C02的細胞培養箱繼(jì)續培養。

三、細胞凍存

細胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，去培養基，10mlPBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA，放人細胞培養箱3min。加入ImlDMEM

培養基終止消化，轉移至15ml離(lí)心管。加入10mlPBS清洗細胞培養盤(pán)，轉移至15ml離(lí)心管，2000rpmX2min，棄上清液。

加入Iml凍(dòng)存液（90%血清，10%DMSO），放入凍(dòng)存盒内（盒内有異丙醇，以保證溫度降低的速度），立即放入一80℃C冰箱内，過(guò)夜，

第二天放入液氮中，可以保存至少兩(liǎng)年，如不放人液氮，可以保存三個(gè)月。

凍(dòng)存液的配制：70%培養基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，邊(biān)滴邊(biān)搖。

進(jìn)入細胞間(jiān)開始細胞培養時，必須嚴格按照下列步驟操作：

①確(què)定所有的細胞操作用的溶液和耗材都已經消毒並(bìng)檢測沒有問題，不確(què)定的溶液和耗材請勿使用，除非特殊情況，不要借用别人的溶

液。

②確(què)定衣服的袖口已經(jīng)卷起或者白大褂的袖口已經(jīng)紮緊。

③確(què)定酒精燈内的酒精量，需要的話及時進行補(bǔ)充。

④確(què)定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。爲瞭(le)方便單手開啓瓶蓋，實驗開始可以把所有瓶蓋旋松。

②盡量不要直接傾倒溶液，除非瓶口沒有被燒壞。如果傾倒失敗(bài)，溶液粘在瓶口，請用噴過(guò)75%酒精的紙巾仔細清潔瓶口周圍後在火焰上簡單燒灼。6操作時如果不能肯定所用的耗材是潔淨的，必須及時更換。實驗完畢(bì)及時收拾，保持工作區域清潔整齊，後(hòu)用75%酒精清潔台面。