ELISA方法現在已經被廣泛的應用於各種抗原和抗體測定。抛開試劑盒本身質量外，我們在實驗中也有很多因素都會影響試驗的正常結果。其中最常出現的問題是顯色淡，靈敏度偏低、重複性不佳、假陽性結果和假陰性結果，不管出現什麽樣的結果都會直接影響我們的實驗結果。下面來分析ELISA實驗非正常檢測結果産生的常見原因，並分析其解決辦法，以提高檢測質量。

1、方法學的影響

ELISA 測(cè)定模式包括以下幾種: 雙抗體夾心法、間接法、雙抗原夾心法、IgM 抗體捕捉法、競争抑制法, 其中競争抑制法因受操作時差所引起的競争等因素的影響, 結果重複(fù)性較差, 質量較難控制。

2、試劑因素

試劑的選擇　檢測的原理均基於(yú)抗原抗體反應。由於(yú)該反應過程受多種因素的影響, 如普遍存在基質效應、交叉反應等, 因而檢測結果難以溯源, 不同方法、不同試劑之間甚至同一試劑不同批号間結果均缺乏可比性。試劑質量在很大程度上決定瞭(le)檢測的水平, 因此在引入新項目之前必須對試劑進行嚴格的評估。試劑的評估有以下幾個步驟: (1) 確定開展該項目的必要性; (2) 瞭(le)解該項目現有的檢測方法和原理; (3) 在瞭(le)解試劑的組成基礎上選擇多家試劑盒進行比較,判斷标準參考方法或參考物質, 其次爲臨床的滿意度及機構的報告如各級室間質量評價、CDC 報告等; (4) 定期對檢測結果進行追蹤反饋直至最終認可該試劑。

3、樣本因素

标本幹擾因素包括内源性幹擾因素和外源性幹擾因素,前者包括類風濕因子、補(bǔ)體、異嗜性抗體、自身抗體等, 後者包括标本溶血、标本被污染、标本貯存時間過長、标本凝固不全、冷凍标本的反複凍融等。其中外源性幹擾因素是我們在檢測(cè)過程中可以避免也是必須避免的因素, 而避免内源性因素的幹擾則主要通過選擇合适的試劑盒。在臨床中遇到少見的疑難病例時應當考慮到内源性幹擾因素的存在。以下對外源性幹擾因素進行簡要說明:

标本溶血　要注意避免出現嚴重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團, 其具有類過氧化物的活性, 因此, 在以辣根過氧化物酶(ho rseradish peroxidase,HRP) 爲标記酶的ELISA 測(cè)定中, 如果血清标本中血紅蛋白濃度較高, 則其就很容易在溫育過程中吸附於(yú)固相, 從而與後面加入的底物反應顯色。

ELISA 操作步驟複雜, 操作不當将引起較大的誤差。以下叙述各個步驟中的影響因素。加樣器是一種比較精密的工具, 其在長時間使用時會因機械磨損或者推動杆内附著血痂等原因造成加樣不準, 尤其是對於樣本量較大的臨床實驗室, 因此必須定期對加液器進行維護和校準。每次加不同的标本時均需更換吸嘴, 以免發生交叉污染。加樣時速度不可太快, 避免将标本加在孔壁上部, 並注意不要濺出或産生氣泡。加樣時還應當注意操作時差對結果的影響, 操作時差是指加入标本、試劑及混勻時間的差異。操作時差在每個實驗中都存在, 尤其是手工操作, 日常檢測标本多達幾百個,從加入第一個标本到最後一個标本, 需幾十分鍾, 加入試劑及混勻等均存在著前後時間差異, 使抗原抗體反應和酶促反應時間不一緻, 操作時差對競争法檢測的結果影響更大, 在加酶結合物和底物時可用定量多道。