感受态細胞主要原理就是通過處理使細胞的通透性變(biàn)大,直觀的說,使得細胞膜表面出現一些孔洞,便於(yú)外源基因或載體進入感受态細胞。由於(yú)細胞膜的流動性,這種孔洞會被細胞自身所修複。
感受态細胞制作方法:
CaCl2法
1. 将快速生長的大腸杆菌置於經低溫(0℃)預處理的低滲氯化鈣溶液中,便會造成細胞膨脹,同時Ca2+會使細胞膜磷脂雙分子層形成液晶結構,促使細胞外膜與内膜間隙中的部分核酸酶解離開來,離開所在區域,誘導細胞成爲感受态細胞
細胞膜通透性發生變(biàn)化,極易與外源DNA相粘附並(bìng)在細胞表面形成抗脫氧核糖核酸酶的羟基-磷酸鈣複合物。
聯合其它的二價金屬離子(如Mn、Co)、DMSO或還(hái)原劑等物質處(chù)理細菌,則可使轉化率提高100~1000倍。
2. 此時,将該體系轉移到42℃下做短暫的熱刺激(90s),細胞膜的液晶結構會發生劇烈擾動,並随機出現許多間隙,外源DNA就可能被細胞吸收。進入細胞的外源DNA分子通過複制、表達,實現遺傳信息的轉移,使受體細胞出現新的遺傳性狀。
3. 将轉化後的細胞在選擇性培養基上培養,篩選出帶有外源DNA分子的陽性克隆。
電轉法
電擊法不需要預先誘導細菌的感受态,依靠短暫的電擊,促使DNA進入細菌,轉化率zui高能達(dá)到109~1010轉化子/ug閉(bì)環DNA。因操作簡便,愈來愈爲人們所接受