ZO-1/大鼠緊密連接蛋白1檢測試劑盒

ZO-1/大鼠緊密連接蛋白1檢測試劑盒
簡介
緊密連接蛋白1，也被稱爲ZO-1或TJP1，是由TJP1基因編碼的外周膜蛋白。它屬於zonula閉塞蛋白家族（ZO-1，ZO-2和ZO-3），它們是緊密連接相關蛋白，其中ZO-1是個被克隆的。1986年，Stevenson和Goodenough使用齧齒動物肝髒中培養的單克隆抗體分離出它，以識别全肝勻漿和緊密連接富集膜級分中的225-kD多肽。它具有作爲支架蛋白的作用，其交聯並(bìng)錨定緊密連接（TJ）鏈蛋白，這些緊連接（TJ）鏈蛋白是脂質雙層内的原纖維狀結構，與肌動蛋白細胞骨架相連。編碼的蛋白質可能參與細胞-細胞連接處的信号轉導。已經爲該基因鑒定瞭(le)兩個編碼不同亞型的轉錄本變體。

本試劑盒大鼠ZO-1免疫測(cè)定是一種三步法固相夾心ELISA，用於(yú)測(cè)量細胞培養上清液、血清和血漿中的大鼠ZO-1。試劑盒包含大腸杆菌表達重組大鼠ZO-1和針對重組蛋白産生的抗體。使用天然大鼠ZO-1獲得的結果顯示出與使用重組标準品獲得的标準曲線平行的線性曲線。這些結果表明，該試劑盒可用於(yú)測(cè)定天然大鼠ZO-1的相對質量值。

檢測原理

試劑盒採用雙抗體夾心法ELISA技術：将捕獲抗體包被於(yú)酶标闆上，捕獲樣品及标準品中的待測物ZO-1，孵育清洗後，再加入标記的檢測抗體進行孵育後清洗，形成“捕獲抗體-抗原-檢測抗體"免疫複合物，随後加入鏈黴親和素偶聯的辣根過氧化物酶進行孵育，待孵育結束後清洗，接著(zhe)加入TMB顯色液後，若樣本中有待測物則顯藍色，則加入終止液停止反應。檢測過程中遊離的成分均被洗去，用酶标儀在450nm處測OD值，顔色的深淺和樣品中的待測物的含量呈正比，通過繪制标準曲線計算出樣本中ZO-1的濃度。
操作要點

1. 混合蛋白質溶液時，應始終避免起泡。爲瞭(le)避免交叉污染，在添加每個标準品、樣品和試劑時應更換移液器槍頭。此外，每種試劑應單(dān)獨使用容器。

2. 確(què)保試劑不間斷地添加到闆孔中。爲瞭(le)確(què)保準確(què)的結果，在孵育步驟中需要粘合好封闆膜。

3. 當(dāng)使用自動洗闆機時，在加入洗滌緩沖(chōng)液後加入30秒的浸泡期，或者在洗滌步驟之間将闆旋轉180度，可以提高測(cè)定精度。

4. 顯色劑應保持無色，直到添加到闆中。確(què)保顯色劑不受光線照射。顯色劑應從無色變(biàn)爲藍色。

5. 應按照與顯色劑相同的順序将終止液添加到闆中。加入終止液後，孔中形成的顔色将從(cóng)藍色變(biàn)爲黃色。綠色的孔表示終止液未與基質溶液充分混合。

需要的其他材料

1. 酶标儀，包含450nm測(cè)定波長(zhǎng)，同時包含600-680nm校正波長(zhǎng)更佳；

2. 移液器及槍頭；

3. 蒸餾水或去離子水；

4. 100-1000 mL刻度量筒；

5. 洗瓶、排槍或自動(dòng)微孔闆清洗機(jī)；

6. 水平軌道微孔闆振蕩(dàng)器，能夠(gòu)保持500±50 rpm的速度；

7. 用於(yú)稀釋(shì)标準品和樣品的試管。
注意事項

1. 本試劑(jì)盒提供的終止液爲稀硫酸溶液，具有一定腐蝕性，應謹(jǐn)慎操作。

2. 本試劑盒中的某些成分含有防腐劑，可能會引起皮膚(fū)過敏反應，應佩帶(dài)口罩避免吸入薄霧。

3. 顯色劑B可能會引起皮膚(fū)、眼睛和呼吸道刺激，應佩帶(dài)口罩避免吸入薄霧。

4. 佩戴防護手套、眼睛和面部防護用品，處(chù)理後(hòu)洗手。

試劑準備

1. 使用前将所有試劑(jì)置於(yú)室溫平衡30分鍾左右。

2. 洗滌(dí)液/稀釋液配置：如果洗滌(dí)液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱⾄晶體全部溶解。用蒸餾(liú)水1: 20稀釋（例如：1mL濃縮洗滌(dí)液加入19mL的蒸餾(liú)水）
ZO-1/大鼠緊密連接蛋白1檢測試劑盒
标準品配置

試劑盒中取出标準品，準備7個試管，先從200ng/mL标準品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至10ng/mL（例：50μL的标準品母液+950μL的1×稀釋液，制備(bèi)得到1000μL的10ng/mL濃度标準品），随後在6個試管中分别加入500μL的1×稀釋液，在這6個單(dān)獨的試管中将10ng/mL标準品依次2倍倍比稀釋至6個梯度，共配制7個濃度的标準品，依次爲： 10ng/mL、 5ng/mL、 2.5ng/mL、 1.25ng/mL、 0.625ng/mL、  0.312ng/mL、 0.156ng/mL，從濃度标準品溶液中吸取500μL标準品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行标準品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度标準品(0ng/mL)。

結果的計算
計(jì)算标準品和樣本複(fù)孔的平均OD值並(bìng)減去空白孔的OD值作爲校正值。以濃度爲橫坐标，OD值爲縱坐标，在坐标紙上繪出四參數邏輯函數的标準曲線（作圖時去掉空白組的值）或者使用能夠生成四參數邏輯（4-P）曲線拟合的計算機軟件來創建标準曲線。若樣品OD值高於(yú)标準曲線上限，應适當稀釋後重測並(bìng)在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數。
示例數據

以下數據(jù)和曲線僅供參(cān)考，實驗者需根據(jù)自己的實驗數據(jù)建立标準曲線。

本圖所示标準曲線僅供示例，結果計(jì)算應以同次試驗标準品所繪(huì)标準曲線爲準計(jì)算樣本結果
靈敏度

經樣本測(cè)試，本試劑(jì)盒的檢測(cè)靈敏度爲0.08ng/mL。

特異性

該(gāi)試劑盒測(cè)定可識别天然和重組大鼠ZO-1。

其他相關蛋白在稀釋緩沖(chōng)液中制備(bèi)爲50ng/mL，並(bìng)測(cè)定交叉反應性。沒有觀察到明顯的交叉反應。

實驗步驟彙總
1. 加标準品及樣(yàng)品，37℃避光反應1.5h，洗滌(dí)3次。

2. 加檢測抗體，37℃避光反應(yīng)1h，洗滌(dí)4次。

3. 加酶結合物，37℃避光反應(yīng)30分鍾，洗滌(dí)4次。

4. 加顯(xiǎn)色液，37℃避光反應(yīng)15分鍾。

5. 加終止液，在5分鍾内讀(dú)數(shù)。

大鼠緊密連接蛋白1用於(yú)定量檢測(cè)細胞培養上清、血清、血漿中大鼠的ZO-1使用本産(chǎn)品之前，必須完整閱讀(dú)本說明書，大鼠ELISA試劑盒僅供科研使用，不能於(yú)其它診斷(duàn)。