鴨胚胎肝間質細胞永生化

鴨胚胎肝間質細胞永生化
細胞特性
1）來源：上海中科院動物研究所
2）含量：>5x105個/mL
3）污染：支原體、細菌、酵母和真菌檢測爲陰性
4）規格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

鴨胚胎肝間質細胞永生化細胞培養步驟
一．培養基及培養凍存條件準備：
1)準備鴨胚胎肝髒間充質幹細胞*培養基（dmem 高糖和F12培養基1：1搭配，10%血清 ，1%雙抗以及1％自己配置的間質細胞因子。）。
2)培養條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養箱濕度爲70%-80%。
3)凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配，液氮儲存。

二．細胞處理：
1）複蘇細胞：将含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，離心管加入4mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心4-5分鍾，棄去上清液，補加1-2mL培養基後吹勻。然後将所有細胞懸液加入T25培養瓶中培養，補加培養基至6ml。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

對於貼壁細胞，傳代可參考以下方法：
1.棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）於培養瓶中，置於37℃培養箱中消化1-2分鍾，然後在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓並脫落，迅速拿回操作台，輕敲幾下培養瓶後加2ml*培養基終止消化。
3.輕輕打勻後吸出，在1000RPM條件下離心5分鍾，棄去上清液，加1-2mL培養液後吹勻。
4. 将細胞懸液按1：2到1:5比例分到新的含6ml培養基的新皿中或者瓶中。
3）細胞凍存：待細胞生長狀态良好時，可進行細胞凍存。

下面T25瓶爲例；
1．細胞凍存時，棄去培養基後，PBS清洗瓶底1-2次後加入1ml胰酶，細胞變圓脫落後，加入2ml*培養基終止消化，可使用血球計數闆計數。
2．1000RPM離心5分鍾去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至終濃度爲10%。加入DMSO後迅速混勻，按每1ml的數量分配到凍存管中，注意凍存管做好标識。本公司按每個凍存管細胞數目大於1X106個細胞凍存。
3．将凍存管置於程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個小時以後轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

注意事項： 
1. 收到細胞後，若發現幹冰已揮發幹淨、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即緻電我們。
2. 所有動物細胞均視爲有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全台内操作，並請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌後方能丢棄。
*次處理細胞時，在超淨工作台中打開瓶蓋，用浸透75%的酒精棉球擦拭瓶口外側，以防止溢出的培養基污染細胞。

細胞介紹

間充質幹細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是來源於早期中胚層的一類多能幹細胞, 在體内具有分布廣泛, 體外能夠大量擴增和免疫原性低等特點, 是一種細胞治療的理想種子細胞。自20世紀60年代，Friedenstein等發現在人骨髓長期培養中, 存在一種形态類似成纖維細胞的貼壁生長的細胞且移植到小鼠體内具有成骨能力和造血支持作用, 将這種細胞命名爲骨髓基質細胞(Bone marrow stromal cells, BMSCs)。到20世紀90年代末, 人們才成功分離一種具有成骨、成軟骨和成脂肪能力的細胞, 稱之爲間充質幹細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)。
随後研究者也從其他組織, 如脂肪、臍帶、胎盤、肝髒、骨實質和肌肉等中成功分離獲得間充質幹細胞。作爲一類成體幹細胞中的間充質幹細胞, 目前大部分的研究集中在人及大鼠、小鼠這兩種模式動物上, 其他動物的間充質幹細胞報道相對較少。選取中國*家禽品種鴨子爲實驗材料, 以鴨胚胎肝髒中的間充質幹細胞爲研究對象, 對其進行分離培養鑒定, 進行增殖能力檢測及分化能力鑒定, 爲家禽幹細胞研究及畜禽遺傳資源保存提供借鑒及參考。鴨胚胎肝間質細胞進行慢病毒轉染8-12h，連續傳13代，採用高濃度含嘌呤黴素培養基（4μg/mL）培養，篩選陽性克隆；篩選出陽性永生化鴨胚胎肝間質細胞。
 

鴨胚胎肝間質細胞永生化運輸和保存：可選擇幹冰運輸及發送複蘇存活細胞方式：（1）幹冰運輸，收到後立即轉入液氮凍存或直接複蘇；（2）存活細胞，收到後應繼續生長，傳代達到細胞生長狀态良好時，再進行凍存。具體操作見細胞培養步驟。=

細胞用途：僅供使用。