本試劑盒用於(yú)體外定量檢測(cè)血清、血漿、組織勻漿及相關液體樣本中牛1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)的含量。

有效期：6個月

保存條件：2-8℃

牛1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)試(shì)劑(jì)盒組成：

備注：

1. (96T/48T)打開包裝後(hòu)請及時檢(jiǎn)查所有物品是否齊全。

2. 标準品濃(nóng)度依次爲(wèi)：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 經過大量正常标本檢驗，标本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測(cè)範圍内，實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可。當(dāng)有部分樣本值超過大标準品濃度時，可用樣本稀釋液将标本進行适當(dāng)稀釋後再進行實驗。

檢測前準備工作：

1.請提前20分鍾從(cóng)冰箱中取出試劑(jì)盒，平衡至室溫。

2.從(cóng)冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶，屬於(yú)正常現象；放置室溫，輕搖均勻，待結晶溶解後再配置洗滌液。可将20ml濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水稀釋配置成400ml工作濃度的洗滌液，未用完的放回4℃

3.20×洗滌(dí)緩沖(chōng)液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌(dí)緩沖(chōng)液加19份蒸餾水。

實驗原理：

試劑盒採(cǎi)用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。往預先包被牛1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)捕獲抗體的包被微孔中，依次加入标本、标準品、HRP标記的檢測抗體，經過溫育並(bìng)洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，並(bìng)在酸的作用下轉化成終的。顔色的深淺和樣品中的牛1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)呈正相關。用酶标儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值)，計算樣品濃度。

實驗所需自備試驗器材：

1.酶标儀(450nm)

2.高精度加樣器及槍(qiāng)頭(tóu)：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾水或去離子水

樣本處理及要求：

1.血清：将收集於(yú)血清分離管的全血标本在室溫放置2小時或4℃過夜，然後1000×g離心20 分鍾，取上清即可，或将上清置於(yú)-20℃或-80℃保存，但應避免反複凍(dòng)融。

2.血漿：用EDTA或肝素作爲抗凝劑採集标本，並(bìng)将标本在採集後的30分鍾内於(yú)2-8℃ 1000×g離心15分鍾，取上清即可檢測，或将上清置於(yú)-20℃或-80℃保存，但應避免反複凍融。

3.組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果)，稱重後将組織剪碎。将剪碎的組織與對應體積的PBS(一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據實驗需要适當調整，並(bìng)做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中，於冰上充分研磨。爲瞭(le)進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反複凍融。後将勻漿液於5000×g離心5~10分鍾，取上清檢測。

4.細胞培養物上清：請1000×g離心20分鍾，取上清即可檢測(cè)，或将上清置於(yú)-20℃或-80℃保存，但應避免反複凍融。

5.其它生物标本：1000×g離心20分鍾，取上清即可檢(jiǎn)測(cè)。

6.樣品外觀(guān)：樣品應清澈透明，懸浮物應離(lí)心去除。

7.樣品保存：樣品收集後若在1周内進行檢測(cè)的可保存於(yú)4℃，若不能及時檢測(cè)，請按一次使用量分裝，凍存於(yú)-20℃(1個月内檢測(cè))，或-80℃(6個月内檢測(cè))，避免反複凍融，标本溶血會影響檢測(cè)結果，因此溶血标本不宜進行此項檢測(cè)。

注意事項：

1.嚴格按照規定的時間和溫度進行溫育以保證準確(què)結果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫20-25℃。使用後立即冷藏保存試劑。

2.洗闆不正確(què)可以導(dǎo)緻不準確(què)的結果。在加入底物前確(què)保盡量吸幹孔内液體。溫育過程中不要讓微孔幹燥掉。

3.消除闆底殘(cán)留的液體(tǐ)和手指印，否則影響OD值。

4.底物顯色液應呈無色或很淺的顔色，已經(jīng)變(biàn)藍的底物液不能使用。

5.避免試劑(jì)和标本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結果。

6.在儲(chǔ)存和溫育時避免強(qiáng)光直接照射。

7.平衡至室溫後(hòu)再打開(kāi)密封袋以防水滴凝聚在冷闆條上。

8.任何反應試劑不能接觸(chù)漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。

9.不能使用過期産品。

10.如果可能傳播疾病，所有的樣品都應管理好，按照規定的程序處(chù)理樣品和檢測(cè)裝置。

牛1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)試(shì)劑(jì)盒操作步驟：

1．從(cóng)室溫平衡60min後(hòu)的鋁箔袋中取出所需闆條，剩餘闆條用自封袋密封放回4℃。

2．設(shè)置标準品孔和樣本孔，标準品孔各加不同濃(nóng)度的标準品50μL。

3．樣(yàng)本孔中a加入待測(cè)樣(yàng)本50μL；空白孔不加。

4．除空白孔外，标準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)标記的檢測(cè)抗體100μL，用封闆膜封住反應孔，37℃水浴鍋(guō)或恒溫箱溫育60min。

5．棄去液體，吸水紙上拍幹，每孔加滿洗滌(dí)液(350μL)，靜置1min，甩去洗滌(dí)液，吸水紙上拍幹，如此重複(fù)洗闆5次(也可用洗闆機洗闆)。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加入終止液50μL，15min内，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

實驗結果計算：

繪制标準曲線：在Excel工作表中，以标準品濃度作橫坐标，對(duì)應OD值作縱坐标，繪制出标準品線性回歸(guī)曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

(此圖僅供參考)

性能：

1. 檢測(cè)範(fàn)圍：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.靈敏度：檢測(cè)濃度小於(yú)1.0 pg/mL。

3.特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應。

4.重複性：闆内變(biàn)異系數小於(yú)10% ，闆間變(biàn)異系數小於(yú)15% 。

技術小提示：

1.當(dāng)混合或重溶蛋白溶液時，盡(jǐn)量避免起沫。

2.爲瞭(le)避免交叉感染，配置不同濃度标準品、上樣、加不同試劑都需要更換(huàn)槍頭。另外不同試劑請分别使用不同的移液槽。

3.每次孵育時，請正確(què)使用封闆膠(jiāo)可保證結果的準確(què)性。

4.混合後(hòu)的顯色底物在上闆前應爲無色，請避光保存；假如微孔闆後(hòu)，将由物色變(biàn)成不同深度的藍色。

5.終止液上闆順序應同顯色底物上闆順序一緻；加入終止液後(hòu)，孔内顔色由藍變(biàn)黃；若孔内有綠色，則表明孔内液體未混勻；請充分混合。

說明：

1.由於(yú)現有條件及科學技術水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定與分析，本産(chǎn)品可能存在一定的質量技術風險。

2.的實驗結果與試劑的有效性、實驗者的相關操作以及當(dāng)時的實驗環境密切相關，請務必準備(bèi)充足的标本備(bèi)份。

3.不同批次的同一産品可能會有少許差别，如：檢測(cè)限、靈敏度以及顯色時間等，請依據試劑盒内說明書進行實驗操作，網站電子版說明書僅作參(cān)考。

4.隻有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測(cè)效果，不能混用其他商的産(chǎn)品。隻有嚴格遵守本試劑盒的實驗說明才會得到佳的檢測(cè)結果。