一、無色片

染色結束後(hòu)，切片中見不到任何陽性信号。這是常規(guī)工作中比較常見的現象，出現這種現象，有兩種可能：

1、真陰性結果：整個染色過程沒有出現問題，組織或細胞確(què)實不表達(dá)與抗體相關的抗原。

2、假陰性結果：即此陰性結果不是真實的反映。假陰性結果又可分爲兩種情況：（1）切片中根本就不包含所預期檢查的組織或細胞。出現這種情況，要麽是選擇錯瞭(le)切片、抗體或蠟塊。獲得正確的切片進行染色是獲得正確結果的前提。（2）染色過程中的某一或某些環節出瞭(le)問題。比如，組織未進行抗原修複，有的組織必須經過抗原修複才能檢測抗原表達；或選用瞭(le)隻能用於(yú)冰凍組織而不能用於(yú)石蠟包埋組織的抗體；或一抗失效，雖然抗體失效在理論上是一個逐漸的過，但偶爾也遇到突然失效的情況，抗體長期不用和/或已超過有效期是主要的原因。也可見於(yú)染色過程中漏掉瞭(le)某一環節，如忘記加二抗或三抗，或用瞭(le)兩次二抗而缺少瞭(le)三抗，或配制DAB時少瞭(le)*。爲瞭(le)避免這種簡單的錯誤，有一種簡單的方法：在三抗孵育結束時，将切片上的三抗甩在一張白紙上，在将配制好的DAB滴一滴在白紙的三抗上，觀察是否出現棕色。如果出現瞭(le)，證明三抗和DAB的配制過程沒有錯誤。如果這種DAB再滴到切片上沒有出現任何陽性信号，問題一定是出在三抗以前。如果紙上不出現棕色反應，問題肯定在三抗或DAB的配制過程。這種簡單方法能迅速的幫助我們查找出現問題可能的原因。

二、“雜音"染色片

免疫組化除正常的真實的陽性信号外常常會遇到不正常的背景著(zhe)色，這些非正常的著(zhe)色稱(chēng)爲“雜音"染色。“雜音"染色種類繁多，産生的原因也多種多樣，爲瞭(le)便於(yú)說明，以下将其歸納爲下面幾種。

1、全片著色

全片著(zhe)色是指整個切片全都染上瞭(le)顔色，著(zhe)色的強度可深可淺，總之，分不清那些組織是陽性那些組織是陰性。出現這種現象的原因有：

（1）抗體濃度過高：一抗濃度過高是常見的原因之一。解決辦(bàn)法是，每次使用新抗體前應當對其工作濃度進行測(cè)試，使每一抗體個體化，找到适合自己實驗室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應如此，不能隻簡單的按說明書進行染色。

（2）抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦(bàn)法是，嚴格執行操作規程，最好随身佩帶報(bào)時表或報(bào)時鍾，及時提醒，避免因遺忘而造成時間延長。現在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時間不是傳統的1小時，而是30分鍾，因此，要根據染色結果進行調整。

（3）DAB變(biàn)質和顯色時間太長：DAB最好現用現配，如有沉渣應進行過濾後再用。配制好的DAB不應存放時間太長，因爲在沒有酶的情況下，*也會遊離出氧原子與DAB産生反應而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱裏幾天後再用這種似乎節約的辦(bàn)法是不可取的。DAB的顯色最好在顯微鏡下監控，達到理想的染色程度時立即終止反應。不過當染色片太多時或用染色機時，這樣做似乎不現實，但至少應對一些新的或少用的抗體顯色時進行監控，避免顯色時間過長。

（4）組織變(biàn)幹：修複液溢出後未及時補(bǔ)充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變(biàn)幹的原因。

（5）切片在緩沖液或修複液中浸泡時間太長（大於(yú)24小時）：原因上不清楚，但現象存在。有的實驗室喜歡前一天将切片脫蠟至修複，第二天加抗體進行免疫組化染色，如果将裝有切片和修複液的容器放在4度冰箱過夜，對結果無明顯影響，如果放在室溫，特别是炎熱的夏天，會出現背景著(zhe)色，因此，不可存放時間太長。

（6）一抗變(biàn)質、質量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麽不顯色要麽背景著(zhe)色。用新買的抗體時最好設立陽性對照和用使用過的抗體作比較。

2、切片邊緣著色

切片邊(biān)緣著(zhe)色也是一種常見的現象，這種現象稱爲邊(biān)緣效應。産生的原因：

（1）組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體，每次清洗不易将組織下面試劑洗盡所緻。解決辦(bàn)法：制備優質的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚於(yú)4微米，組織的前期處理應規範，盡量避免選用壞死較多的組織。

（2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊(biān)緣的試劑容易首先變幹，濃度較中心組織高而緻染色深。解決辦(bàn)法：試劑要充分覆蓋組織，應超出組織邊(biān)緣2mm。

3、“陰陽臉"著色

指組織一半著(zhe)色一半無著(zhe)色，形成交界清晰或不甚清晰的兩種染色結果。其成因是試劑僅覆蓋瞭(le)部分組織而不是全部。如加試劑後未讓試劑流散開而集中在部分組織上。通常應該在加完試劑後，仔細看一遍，是否有的組織未被試劑完w全覆蓋，如有這種情況，建議用牙簽而不是用吸頭或試劑瓶口将試劑引流開使之将組織全部覆蓋。另外，染片盒不平，切片傾斜，雖然開始試劑已全部覆蓋瞭(le)組織，但後來試劑流向一邊，部分組織未被試劑覆蓋。對於(yú)這種問題，隻要留心或想到瞭(le)很容易發現，也很容易解決。

4、竈片狀著色

切片中著(zhe)色區東(dōng)一塊西一塊，呈竈片狀分布，出現這種問題的原因有：

（1）裱片時水未排盡，在局部形成氣泡使組織突起，染色時試劑滲入後不易洗盡，顯色過深所緻。解決辦(bàn)法是，漂片盒裏的氣泡應去盡，晾片熱台不能平放，應有45度左右的斜度，利於(yú)水流走和蒸發。

（2）壞死組織竈，組織壞死後細胞破壞、酶的釋放、蛋白遊離、分解，複雜的肽鏈殘段（如Fc段）可能與一抗或/和二抗結合導緻最終著(zhe)色。解決辦(bàn)法是在選擇染色切片時應避免選擇壞死組織較多的切片。

（3）制作APES膠片時，膠的濃度太高，幹燥後在玻片上留下白色小點，顯色時白色小點著(zhe)色。解決辦(bàn)法是按照标準的制備方法進行，即5%鹽酸酒精（5ml鹽酸+95%酒精95ml）浸泡玻片4小時、熱水沖洗玻片1小時、蒸餾水洗玻片1分鍾、丙酮浸泡玻片5秒鍾後空氣幹燥（室溫）、2%APES（2ml APES+98ml丙酮）浸泡玻片5分鍾、玻片過一下丙酮（1-2秒鍾）、玻片過一下蒸餾水（1-2秒鍾）、37度過夜幹燥、室溫儲存備用。如果制片過程中，因丙酮逐漸揮發而膠變濃時可适當加入一些丙酮。

5、間質著色

著(zhe)色部位主要在間質，間質著(zhe)色的原因很多，如抗體與組織中的蛋白質因蛋白疏水基團相互作用形成非特異性的連接而著(zhe)色，加一抗前的血清封閉這一步就是爲瞭(le)避免非特異型的結合。又如血清中的免疫球蛋白常常滲出到組織間質，很容易與抗體結合，造成間質著(zhe)色，特别是lambda和kappa染色時。當甲狀腺膠質外溢到組織間質時，做甲狀腺球蛋白染色也會出現間質著(zhe)色。抗體不純或抗體被污染也可出現間質著(zhe)色，我們曾遇到CD20抗體不純，除瞭(le)染上B細胞外還染上瞭(le)間質。

6、細胞漿著色

胞漿著色是所有“雜音"染色中最j具有欺騙性的著(zhe)色，著(zhe)色區局限在細胞内，間質無著(zhe)色，看上去與真實的免疫反應著(zhe)色幾乎一樣，很難區别。胞漿裏含有較多的蛋白質，因此，很多非特異性的染色除瞭(le)見於間質也可以出現在胞漿中。這種原因造成的著(zhe)色，可以通過血清封閉解決。還有因内源酶造成的著(zhe)色，如血紅蛋白（紅細胞）、肌紅蛋白（肌細胞）、細胞色素（粒細胞、單核細胞）、*酶（肝、腎），這些可用*進行封閉。巨噬細胞吞噬各種抗原物質或Fc片斷而出現胞漿著(zhe)色，這種著(zhe)色不易避免，但可以通過形态學辨認出巨噬細胞而引起重視。内源性生物s素的著(zhe)色最j具有欺騙性，因爲它廣泛的存在於組織細胞中，我們研究結果顯示：冰凍組織中存在内源性生物s素，經福馬林固定石蠟包埋後生物s素被封閉，加熱抗原修複後造成内源性生物s素暴露，内源性生物s素暴露的強度在不同的組織有所不同，從弱陽性（+）到強陽性（+++），内源性生物s素在組織中的分布形式，既有散在分布也有彌漫分布，主要以顆粒狀形式存在於胞漿中，内源性生物s素廣泛存在於上皮源性組織，特别是腺上皮組織，亦存在部分非上皮組織，内源性生物s素不僅存在人體組織也存在大鼠組織，内源性生物s素暴露的強弱與修複液有關，其強度增加依次爲：檸檬酸、EDTA、EGTA，熱抗原修複暴露的内源性生物s素可被雞蛋清封閉，非生物s素檢測系統Polymer兩步法（EliVision、EnVision）可避免生物s素幹擾。

7、細胞核著色

不适當的組織處(chù)理可以出現細胞核著(zhe)色，如組織在二甲/苯裏浸泡時間太長（如從星期五浸泡到下星期一）、緩沖液中浸泡時間太長、組織變幹、微波修複液的pH值和修複時間不當或修複過程中修複液留下得太少，未沒過組織等。解決辦法是嚴格按照操作常規進行工作。免疫組化除正常的真實的陽性信号外常常會遇到不正常的背景著(zhe)色，這些非正常的著(zhe)色稱(chēng)爲“雜音"染色。“雜音"染色種類繁多，産生的原因也多種多樣，爲瞭(le)便於(yú)說明，以下将其歸納爲下面幾種。

1、切片邊緣著色

切片邊(biān)緣著(zhe)色也是一種常見的現象，這種現象稱爲邊(biān)緣效應。産生的原因：（1）組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體，每次清洗不易将組織下面試劑洗盡所緻。解決辦(bàn)法：制備優質的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚於(yú)4微米，組織的前期處理應規範，盡量避免選用壞死較多的組織。（2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊(biān)緣的試劑容易首先變幹，濃度較中心組織高而緻染色深。解決辦(bàn)法：試劑要充分覆蓋組織，應超出組織邊(biān)緣2mm。

2、間質著色

著(zhe)色部位主要在間質，間質著(zhe)色的原因很多，如抗體與組織中的蛋白質因蛋白疏水基團相互作用形成非特異性的連接而著(zhe)色，加一抗前的血清封閉這一步就是爲瞭(le)避免非特異型的結合。又如血清中的免疫球蛋白常常滲出到組織間質，很容易與抗體結合，造成間質著(zhe)色，特别是lambda和kappa染色時。當甲狀腺膠質外溢到組織間質時，做甲狀腺球蛋白染色也會出現間質著(zhe)色。抗體不純或抗體被污染也可出現間質著(zhe)色，我們曾遇到CD20抗體不純，除瞭(le)染上B細胞外還染上瞭(le)間質。

3、“陰陽臉"著色

指組織一半著(zhe)色一半無著(zhe)色，形成交界清晰或不甚清晰的兩種染色結果。其成因是試劑僅覆蓋瞭(le)部分組織而不是全部。如加試劑後未讓試劑流散開而集中在部分組織上。通常應該在加完試劑後，仔細看一遍，是否有的組織未被試劑完w全覆蓋，如有這種情況，建議用牙簽而不是用吸頭或試劑瓶口将試劑引流開使之将組織全部覆蓋。另外，染片盒不平，切片傾斜，雖然開始試劑已全部覆蓋瞭(le)組織，但後來試劑流向一邊，部分組織未被試劑覆蓋。對於(yú)這種問題，隻要留心或想到瞭(le)很容易發現，也很容易解決。

4、竈片狀著色

切片中著(zhe)色區東(dōng)一塊西一塊，呈竈片狀分布，出現這種問題的原因有：（1）裱片時水未排盡，在局部形成氣泡使組織突起，染色時試劑滲入後不易洗盡，顯色過深所緻。解決辦法是，漂片盒裏的氣泡應去盡，晾片熱台不能平放，應有45度左右的斜度，利於水流走和蒸發（2）壞死組織竈，組織壞死後細胞破壞、酶的釋放、蛋白遊離、分解，複雜的肽鏈殘段（如Fc段）可能與一抗或/和二抗結合導緻最終著(zhe)色。解決辦(bàn)法是在選擇染色切片時應避免選擇壞死組織較多的切片。（3）制作APES膠片時，膠的濃度太高，幹燥後在玻片上留下白色小點，顯色時白色小點著(zhe)色。解決辦(bàn)法是按照标準的制備方法進行，即5%鹽酸酒精（5ml鹽酸+95%酒精95ml）浸泡玻片4小時、熱水沖洗玻片1小時、蒸餾水洗玻片1分鍾、丙酮浸泡玻片5秒鍾後空氣幹燥（室溫）、2%APES（2ml APES+98ml丙酮）浸泡玻片5分鍾、玻片過一下丙酮（1-2秒鍾）、玻片過一下蒸餾水（1-2秒鍾）、37度過夜幹燥、室溫儲存備用。如果制片過程中，因丙酮逐漸揮發而膠變濃時可适當加入一些丙酮。

5、細胞漿著色

胞漿著(zhe)色是所有“雜音"染色中最j具有欺騙性的著(zhe)色，著(zhe)色區局限在細胞内，間質無著(zhe)色，看上去與真實的免疫反應著(zhe)色幾乎一樣，很難區别。胞漿裏含有較多的蛋白質，因此，很多非特異性的染色除瞭(le)見於間質也可以出現在胞漿中。這種原因造成的著(zhe)色，可以通過血清封閉解決。還有因内源酶造成的著(zhe)色，如血紅蛋白（紅細胞）、肌紅蛋白（肌細胞）、細胞色素（粒細胞、單核細胞）、*酶（肝、腎），這些可用*進行封閉。巨噬細胞吞噬各種抗原物質或Fc片斷而出現胞漿著(zhe)色，這種著(zhe)色不易避免，但可以通過形态學辨認出巨噬細胞而引起重視。内源性生物s素的著(zhe)色最j具有欺騙性，因爲它廣泛的存在於(yú)組織細胞中，我們研究結果顯示：冰凍組織中存在内源性生物s素，經福馬林固定石蠟包埋後生物s素被封閉，加熱抗原修複後造成内源性生物s素暴露，内源性生物s素暴露的強度在不同的組織有所不同，從弱陽性（+）到強陽性（+++），内源性生物s素在組織中的分布形式，既有散在分布也有彌漫分布，主要以顆粒狀形式存在於(yú)胞漿中，内源性生物s素廣泛存在於(yú)上皮源性組織，特别是腺上皮組織，亦存在部分非上皮組織，内源性生物s素不僅存在人體組織也存在大鼠組織，内源性生物s素暴露的強弱與修複液有關，其強度增加依次爲：檸檬酸、EDTA、EGTA，熱抗原修複暴露的内源性生物s素可被雞蛋清封閉，非生物s素檢測系統Polymer兩步法（EliVision、EnVision）可避免生物s素幹擾。

6、細胞核著色

不适當的組織處(chù)理可以出現細胞核著(zhe)色，如組織在二甲/苯裏浸泡時間太長（如從星期五浸泡到下星期一）、緩沖液中浸泡時間太長、組織變幹、微波修複液的pH值和修複時間不當或修複過程中修複液留下得太少，未沒過組織等。解決辦法是嚴格按照操作常規進行工。