上海酶聯生物在我司原代細胞操作中，我們都認爲實驗的原理似乎很簡單，不外乎固定抗原，添加一抗、二抗和底物，間中夾雜著洗滌和封閉。 

　　原代細(xì)胞培養實(shí)驗步驟：

 

　　1、取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡於75%乙醇消毒3-5min。
 

　　2、在超淨工作台中，将大鼠斷頭置於玻璃培養皿中，打開顱腔後取出全腦,放在盛有預冷的PBS玻璃培養皿中，去除小腦和間腦。
 

　　3、将大腦半球在幹濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預冷的PBS玻璃培養皿中。
 

　　4、用細解剖鑷去除大腦白質、殘餘大血管和軟腦膜，保留大腦皮質。
 

　　5、大腦皮質放於DMEM中(含慶-大黴素和谷-氨酰胺 )，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1%II型膠原酶，0 .025-0 .05%IV型膠原酶，200-400U DNaseI)，混勻後37℃水浴消化1-1.5h。
 

　　6、室溫1 000×g離心8min，去上清液。
 

　　7、沉澱中加入20%BSA重懸浮，充分混勻，1 000×g，20min，4℃離心，去上清。
 

　　8、沉澱加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1%的膠原酶/分散酶，0.05-0.1%I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min，去上清液。
 

　　9、沉澱加入2ml DMEM(含慶-大黴素和谷-氨酰胺)培養液懸浮混勻，鋪於經離心形成連續梯度的12ml 50%Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃離心10min。
 

　　10、靠近底部的紅細胞層之上的白的層面即爲純化的微血管段，吸出後DMEM
 

　　加入DMEM*培養液(20%FBS，4ug/ml嘌呤黴素 )重懸浮，接種於含5%的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細胞培養皿中，置於37℃、5%CO2培養箱内靜置培養24h後更換不含嘌呤黴素的混合培養基，随後隔天換液。
 

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