自從20世紀60-70年代問世以來，elisa法得到*工作者的認可及推崇，在歐美及中國獲得很大的推廣，尤其是國内生化領域的長足發展。elisa試劑盒有著準確性高、靈敏度高、特異性強等很多的優點，它在檢測抗體、抗原等方面有很好的應用，深受廣大用戶朋友的喜愛。然而，在實驗過程中，也需要注意很多問題，特别是顯色、比色問題。

顯色 

顯色是ELISA中的後一步溫育反應，此時酶催化無色的底物有色的産物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間内，陰性孔可保持無色，而陽性孔則随時間的延長而呈色加強。适當提高溫度有助於(yú)加速顯色進行。在定量測定中，加入底物後的反應溫度和時間應按規定力求準確(què)。定性測定的顯色可在室溫進行，時間一般不需要嚴格控制，有時可根據陽性對照孔和陰性對照孔的顯色适當縮短或延長反應時間，及時判斷。

OPD（鄰苯二胺）底物顯色一般在室外溫或37℃反應20-30分鍾後即不再加深，再延長反應時間，可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變(biàn)色，顯色反應應避光進行，顯色反應結束時加入終止液終止反應。OPD産(chǎn)物用硫酸終止後，顯色由橙轉向棕。

TMB（四甲基聯苯胺）受光照的影響不大，可在室溫中置於操作台上，邊反應觀察結果。elisa試劑盒但爲保證實驗結果的穩定性，宜在規定的适當時間閱讀結果。TMB經HRP作用後，約40分鍾顯色達，随即逐漸減弱，至2小時後即可*消退至無色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基*（SDS）等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間（12-24小時）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉變成，此時可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。

比色 

比色前應先用潔淨的吸水紙拭幹闆底附著(zhe)的液體，然後将闆正確放入酶标比色儀的比色架中。以軟闆爲載體的試驗，需先将闆置於(yú)标準96孔的座架中，才可進行比色。在加底物液顯色前，先将軟闆邊緣剪淨，這樣，此闆就可*平妥坐入座架中。

比色時應先以蒸餾水校零點(diǎn)，測(cè)讀底物孔（未經任何反應僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替标本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其後可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然後進行計算。

比色結果的表達以往通用光密度（oplical density，OD），現按規定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，将吸收波長(zhǎng)寫於(yú)A字母的右下角，如OPD的吸收波長(zhǎng)爲492nm，表示方法爲“A492nm”或“OD492nm”。

酶标比色儀

酶标比色儀簡稱酶标儀，通常指於(yú)測讀ELISA結果吸光度的光度計。針對固相載體形式的不同，各有特制的适用於(yú)闆、珠和小試管的設計。許多試劑公司配套供應酶标儀。酶标儀的主要性能指标有：測讀速度、讀數的準確(què)性、重複性、度和可測範圍、線性等等。優良的酶标儀的讀數一般可到0.001，準確(què)性爲±1%，重複性達0.5%。舉例說，若某孔測得的A值爲1.083，則該孔相對於(yú)空氣的真實A值應爲1.083± 0.01(1.073～1.093)，重複測定數次，其A值均應1.083±0.05（1.078～1.088）在之間。酶标儀的可測範圍視各酶标儀的性能而不同。普通的酶标儀在0.000～2.000，新型号的酶标儀上限拓寬達2.900，甚至更高。超出可測上限的A值常以“*”或“over”或其它符号表示。應注意可測範圍與線性範圍的不同，線性範圍常小於(yú)可測範圍，比如某一酶标儀的可測範圍爲0.000～2.900，而其線性範圍僅0.000～2.000，這在定量ELISA中制作标準曲線時應予注意。

酶标儀不應安置在陽光或強光照射下，操作時室溫宜在15-30℃，使用前先預熱儀器15-30分鍾，測(cè)讀(dú)結果更穩定。

測(cè)讀A值時，要選用産(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長。有的酶标儀可用雙波長式測(cè)讀，即每孔先後測(cè)讀兩次，次在适波長（W1），第二次在不敏感波長（W2），兩次測(cè)定間不移動ELISA闆的位置。例如OPD用492nm爲W1，630nm爲W2，終測(cè)得的A值爲兩者之差（W1-W2）。雙波長式測(cè)讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光幹擾。

各種酶标儀性能有所不同，使用中應詳細閱讀elisa試劑盒說明書